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免疫荧光Immunofluorescence


    免疫荧光染色技术是将荧光素作为抗体标记物进行免疫组织化学染色,带有荧光素的抗体孵育后可以直接使用荧光显微镜观测。该技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快;缺点是由于荧光素有一定的淬灭周期,玻片无法长期保存,需要在染色结束后尽快进行镜下观测分析。
免疫荧光染色分为直接法和间接法。直接法是荧光素直接标记在一抗上,孵育后直接观测,快速高效,还可以与多个标记抗体一起做多重荧光染色。间接法是荧光素标记在二抗上,相比直接法染色背景更干净,费用花费也少。

    免疫荧光染色与免疫组化前期处理相同,因为内源性过氧化物酶对免疫荧光实验没有影响,同时双氧水反而会干扰到荧光素发光,所以这步操作在免疫荧光中不需要做。
常用的荧光显微镜一般有三个通路,激发波长为350nm、488nm、555nm附近,分别对应的荧光发射光颜色为蓝光、绿光、红光。
350nm常用荧光素:DAPI(复染用),Alexa Fluor 350
488nm常用荧光素:FITC,Alexa Fluor 488
555nm常用荧光素:PE、Cy3、Rhodamine B、Alexa Fluor555
另有其他常见荧光素
594nm常用荧光素:Texas Red、Alexa Fluor594
647nm常用荧光素:Cy5、APC、Alexa Fluor647

    免疫荧光双重染色荧光双染或多重染色是指将带有不同荧光素标记的抗体孵育在同一张切片上,镜下观察时将不同的颜色组合在一起,将不同的抗原表达情况一起呈现出来,这样分析多个抗原的关联性更客观、更直接。
荧光双染也有直接法和间接法。直接法是使用带有不同荧光素标记的两个抗体同时孵育后观测;间接法需要用到两个不同种属来源的一抗(例如一个鼠源抗体,一个兔源抗体),后面要选择与一抗相对应的二抗同时需要带有不同的荧光素标记(例如FITC标记山羊抗小鼠和Cy3标记山羊抗兔),间接法需要同时兼顾一抗和二抗的种属关系,避免出现相互的交叉反应。


北京亚美游生物石蜡切片的免疫荧光单染(间接法)
1.石蜡切片正常脱蜡至水,PBS洗5分钟,2次
2.抗原修复,0.01M枸橼酸修复液,沸水浴热修复15分钟
3.正常山羊血清封闭20分钟,37℃
4.一抗孵育,4℃过夜。
5.PBS洗5分钟,3次
6.荧光标记二抗孵育,37℃,90分钟
7.PBS洗5分钟,3次
8.DAPI复染,PBS洗5分钟,3次
9.防淬灭荧光封片剂封片
10.镜检

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