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Bioss讲堂 | 高分文章这么用Western Blot
发表者:北京亚美游生物      发表时间:2018-10-19

Western Blot技术应用:Western Blot(WB)是全球生命科学实验室必备技术之一,WB最早是1979年由瑞士科学家Towbin报道,将SDS-PAGE电泳后的蛋白印记在NC膜上,再通过一抗和二抗标记并显色的方法。四十年来,随着标记和检测技术的发展,WB已经变得更加灵敏、快捷,新的抗体也使其应用范围更加广泛。总结下来,WB主要可以用于以下几个方面:

1. 定性分析——未知蛋白的鉴定;

2. 定量/半定量分析——样本内蛋白含量变化;

3. 蛋白构象分析——二硫键、PTM及寡聚化分析;

4. 信号分析——磷酸化、泛素化等信号分子的变化;

5. 标签抗体的灵活运用——蛋白研究更加方便。


本期通过实战举例为大家介绍一下Western Blot技术的应用方向,也许你会发现WB还可以在您的科研工作中发挥更大的作用。


实例解析Western Blot应用

1、目标蛋白定性分析

现有对未知蛋白定性的方法有:

  • 氨基酸测序;

  • 基于质谱(MS)的肽指纹图谱分析(电泳+MS/MS、HPLC+MS、MALDI-TOF);

  • 基于特异性抗体的方法(抗体芯片、WesternBlot)。

相对而言,前两种方法耗时且对仪器设备要求高,而基于抗体的蛋白鉴定方法则比较方便快捷。

       本文通过传染性肠胃炎病毒(TGEV)感染猪睾丸细胞后的蛋白组学变化,发现23种蛋白上调,10种蛋白下调(图A),并用WB鉴定角质蛋白19(keratin 19)、a-微管蛋白(a- tubulin)和抗增殖蛋白(prohibitin)(图B)参与了病毒的感染过程,表明该病毒感染与细胞结构完整性、囊泡运输及RNA处理、蛋白合成调控等有关。





2、目标蛋白定量/半定量分析

WB最经典的用途及最主要的实验目的就是对蛋白表达进行定量或半定量分析。

通过设置适当内参蛋白,将感兴趣的蛋白对内参进行归一化,即可比较试验前后样本中某蛋白相对含量的变化,即为半定量研究。

     文中利用WB对目标蛋白进行了半定量研究。在这篇文章中,Rijn等通过WB方法发现先天性腹泻(CDD)病人及其父母DGAT1蛋白表达缺失。作者通过DNA测序分析了DGAT基因,确定了DGAT1基因五个新的纯合变异体,其RT-PCR发现cDNA异常切割,因此DGAT蛋白无表达。这造成细胞脂代谢异常。文章通过基因敲除法构建了DGAT1缺失型类小肠器官,还在Caco-2细胞系中重组表达了DGAT1和DGAT2,目的是体外模拟DGAT蛋白缺失及重建后对脂代谢的影响。类小肠器官及细胞系中DGAT蛋白的表达都是通过WB方法得以确定的。该实验证实,敲除DGAT1蛋白造成脂代谢紊乱,对细胞造成脂毒性,重建DGAT1或DGAT2可恢复脂代谢。




3、目标蛋白构象结合功能分析

WB用于构象分析,主要基于其不同构象形式时分子量所发生的变化,比如不同的寡聚、翻译后修饰、配体结合等情况。

  • 还原和非还原型电泳分析链间二硫键,并判断蛋白聚合情况;

  • 抗体表位分析法初步判断蛋白空间结构;

  • 利用(N-端或C-端)抗体研究蛋白异构体及翻译后酶切修饰;

  • 更重要的是,WB等方法获得的是蛋白在寡聚、结合配体、底物、信号标签等生理条件下,其分子量的动态变化,从而将蛋白结构研究与功能研究有机结合。

案例Ⅰ

      泛素化-蛋白酶体系统对于错误蛋白降解具有重要意义。左图显示Nrf2蛋白在泛素连接酶作用时间延长后,泛素化程度逐渐增加。若将各时间点的Nrf2蛋白结构解析,即可将该蛋白的结构研究与功能研究相结合。在Virology的这篇文献中,作者发现蛋白酶体抑制剂MG132和lactacystin可显著降低猪II型圆环病毒(PCV2)早期感染的滴度,并通过对泛素基因的沉默实验,发现其也显著降低PCV2滴度,由此推断泛素-蛋白酶体系统是PCV2的早期复制所必须的。


案例Ⅱ

      硝基化促使a-突触核蛋白(a-synuclein)寡聚,以及寡聚化的a-synuclein促使人神经胶质瘤细胞SH-SY5Y凋亡,并呈时间剂量效应的研究。WB结果显示硝基化程度加深,a-synuclein呈现了二聚及多聚特性。硝基化的a-synuclein激活了iNOS并抑制了FAK,这两条信号可能都参与了促SH-SY5Y凋亡作用。作者还发现integrin抗体部分抑制了细胞凋亡,将已有的integrin/FAK/caspase 3信号通路改变为integrin-iNOS/-FAK/caspase 3信号通路。




4、磷酸化信号分析

磷酸化是细胞信号系统的重要调节方式,特异的磷酸化抗体可以用于:

  • 分析信号分子磷酸化水平,从而与其功能研究建立联系;

  • 分析不同磷酸化位点对于信号分子功能的影响,比如p53总磷酸化水平与不同位点磷酸化水平对转录的调控,以及与癌症发生发展之间的联系。

案例Ⅰ

Cai等在JBC上发表的文章,揭示了微小RNA在肿瘤发生中的调节作用。研究发现微小RNA miR-17/20a靶向抑制p53的核心激酶DAPK3(死亡相关蛋白激酶3)的表达,去除这些微小RNA将导致依赖于p53的微小RNA转录抑制被去除,从而形成一个正反馈环,促进肿瘤形成,它们被称为原癌微小RNA(oncomiRs)。C图清楚显示了当对Hela细胞转入miR-17、miR-20a或miR-17/20a拮抗剂后,DAPK3蛋白表达增加,双链DNA不稳定性的标志物ATM(Ser-1981)、p53BP1(Ser-25/29)蛋白丝氨酸磷酸化程度增高,而各自总蛋白水平并没有变化。D图进一步确认了这些磷酸化水平升高是由DAPK3表达量升高引起的。p53磷酸化水平升高将导致其抑制原癌微小RNA转录的水平下降,进一步提高DAPK3激酶的表达。该研究补充了原有的通过E2F家族蛋白激活miR-17/20a的负反馈调节通路。


案例Ⅱ

      糖尿病代谢紊乱可能会增加阿尔茨海默症(AD病)风险,其病理机制是导致Ab和tau蛋白表达量的增加。在Clin Interv Aging杂志的文章中,作者发现四环素衍生药物二甲胺四环素可降低糖尿病模型大鼠的Ab蛋白表达,tau蛋白磷酸化及炎症因子如IL-1b等的表达。证实该药物是通过抑制糖尿病代谢紊乱所引起的炎症反应而淀粉样前体的形成。WB结果显示,药物处理前后总tau蛋白并无变化,但神经元内斑块标志物T231和S214磷酸化tau的磷酸化程度明显降低,胞间斑块标志物PHD指形蛋白1(PHF-1)的磷酸化也明显降低。




5、标签抗体的灵活运用

生物学研究已开发出许多标签蛋白,如FLAG、His、GST、c-Myc、SUMO、GFP荧光蛋白等,它们极大地方便了蛋白的表达、纯化、示踪及定性、定量的多项研究。利用标签抗体的优势有:

  • 同一标签抗体研究不同的融合蛋白;

  • 融合蛋白可用anti-靶点抗体和anti-标签抗体双重鉴定;

  • GFP标签即可用于IF/ICC检测,又可用于WB等检测;

  • 标签(如FLAG、HA)抗体用于融合蛋白的IP或co-IP较ProA/G偶联方便快捷。

标签抗体常用于Western Blot实验中:

  • 重组或敲除细胞系的鉴定;

  • 融合蛋白表达量的差异;

  • 在目标蛋白的不同位置加标签,再通过相应的标签抗体检测来实现对蛋白功能区的划分和鉴定。

案例Ⅰ

      Radics等在脂膜上设计了精巧的针形通道,模拟在细菌膜上的3型分泌系统(注射体,”injectisomes”),研究注射体的结构及工作原理。作者通过设计目标蛋白SptP(WT)及其FLAG和GFP标签融合蛋白,FLAG标签可用于示踪蛋白在胞内和胞外的分布。由于带有GFP标签的融合蛋白不能通过该通道,GFP标签起到了使SptP形成蛋白-通道复合体的作用,可用冷冻电镜解析复合体的结构。利用金标抗GFP抗体可在电镜下显示复合体的形成。


案例Ⅱ

      本文利用标签蛋白研究蛋白的功能区。Yang等在研究单纯疱疹病毒(HSV)出芽复合体的形成机制时,设想病毒蛋白pUL31的C端25个Aa对于其结合衣壳蛋白及核蛋白形成核出芽复合体(NEC)非常重要,于是设计带有HA标签的pUL31蛋白31HA,缺少C端25个Aa的31HA/560S,以及缺少pUL25区的31HA/25 null,发现pUL31及缺少pUL25的pUL31可以结合衣壳蛋白,但缺少C端25个Aa的31HA/560S不能结合。利用金标记HA抗体可在电镜下观察到衣壳蛋白顶端与pUL31形成复合体的情形。

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